Guardando bud HIV dalle cellule: studio mostra ruolo last-minute di proteine ​​chiamato ALIX

Giugno 1, 2016 Admin Salute 0 18
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"Guardiamo una cella alla volta", e usa una macchina fotografica digitale e speciale microscopio per fare film e le foto del processo in erba, dice virologo Saveez Saffarian, un assistente professore di fisica e astronomia e senior autore di un nuovo studio di HIV in erba pubblicato oggi online Public Library of Science rivista PLoS ONE.

"Abbiamo visto ALIX reclutato in HIV in erba per la prima volta," dice. "Tutti sapevano ALIX si occupa di HIV in erba, ma nessuno poteva immaginare il reclutamento di ALIX nel processo."




La scoperta è "scienza di base fondamentale" e non ha alcun significato clinico immediata per i malati di AIDS perché ALIX è coinvolto in troppe funzioni critiche come la divisione cellulare per essere un probabile bersaglio per nuovi farmaci, dice Saffarian.

"Sappiamo molto sulle proteine ​​che aiutano HIV uscire dalla cella, ma non sappiamo come vengono insieme per aiutare il virus uscire, e sarà nei prossimi 10 o 20 anni che sapremo molto più di questo meccanismo ", aggiunge. "Questo sarebbe un obiettivo di droga? Questa sarebbe una parte della biochimica utilizzato in un settore terapeutico o biotech più tardi? Non posso dirvi ora. Ma se non fosse per la nostra curiosità come specie, non avremmo la tecnologia che abbiamo oggi. "

Il nuovo studio "è bello lavoro", dice l'HIV in erba esperto Wes Sundquist, che ha consigliato Saffarian ed è professore e co-presidente di biochimica presso la University of Utah School of Medicine. "E 'di genuino interesse per quelli di noi che studiano il meccanismo di montaggio HIV."

Lo studio è stato finanziato dalla National Science Foundation. Saffarian condotto lo studio con primo autore, Pei-I Ku, una Università dello Utah studente di dottorato in fisica; Mourad Bendjennat, un borsista post-dottorato in fisica e astronomia; tecnico Jeff Ballew; e Michael Landesman, un altro borsista post-dottorato in fisica e astronomia che ha già lavorato nel laboratorio di biochimica di Sundquist.

Guarda, non toccare, come germogli HIV

Metodi biochimici utilizzati per anni comportano raccolta milioni di virus nel laboratorio di vetro e facendo diverse analisi per rivelare le proteine ​​che compongono il virus - per esempio, utilizzando anticorpi che si legano ad alcune proteine ​​e con altre proteine ​​che rendono le prime proteine ​​reagiscono così possono essere visti.

"Non stai facendo un virus alla volta", dice Saffarian. "Il problema è che non si vede le differenze tra virus simili. E non si vede i tempi di come le varie proteine ​​vanno e vengono per aiutare il virus uscire dalla cella."

Altri metodi congelare o altrimenti fissare celle come nuove particelle HIV emergono da loro, e utilizzare un microscopio elettronico a fotografare quelle viste freeze-frame di replicazione virale. Saffarian anche utilizza la tecnologia nota come "microscopia a riflessione interna totale fluorescenza", che è stato utilizzato per esaminare processi dinamici nelle cellule.

Il metodo è stato usato prima per rendere le immagini della gemmazione dell'HIV e un virus cavallo simile, EIAV. Ma Saffarian dice che lo studio non ha mostrato ALIX essere coinvolti in HIV in erba, e aveva difetti che a torto indicato la proteina ALIX stato coinvolto molto presto nel processo EIAV erba, suggerendo che ha fatto lo stesso in gemmazione dell'HIV.

Ku, Saffarian e colleghi combinati che il metodo di microscopia con un modo migliore di geneticamente collegando un '"etichetta" verde fluorescente alle proteine ​​ALIX in cellule clonate in modo che possano vedere le proteine ​​senza danneggiare la loro normale funzione. I ricercatori hanno provato numerosi cosiddetti "linker" e trovato quello che far loro vedere le proteine ​​ALIX come sono stati coinvolti in HIV in erba, ma senza disturbare il processo.

Né la tecnologia del microscopio né proteine ​​di etichettatura con fluorescenza verde sono nuovi, ma "quello che abbiamo fatto ciò che è nuovo è abbiamo collegato queste proteine ​​fluorescenza per ALIX utilizzando diversi tipi di linkers" per trovare uno che lascia la funzione della proteina ALIX correttamente, aggiunge.

Il problema con la ricerca precedente - che ha indicato ALIX è stato coinvolto nelle prime fasi del processo di gemmazione - è che solo un linker è stato utilizzato, ed è compromessa la funzione normale ALIX ', dice Saffarian.

Guardando Proteine ​​Forming HIV

Quando l'HIV si replica all'interno di una cellula umana, una proteina chiamata Gag costituisce la maggior parte delle nuove particelle - ci sono 4.000 copie della proteina Gag in una particella HIV - anche se un po 'di altre proteine ​​coinvolto nel processo, tra cui ALIX, che sta per "ALG-2 interagendo proteina x." Esperimenti come quelli di uso team di "particelle virus-simili," di Saffarian che sono particelle di HIV spogliati del loro programma genetico o genoma in modo che non rappresentano un rischio di infezione in laboratorio.

"Particelle virus-simili mantengono la stessa geometria e lo stesso processo di gemmazione come infettivo", dice Saffarian.

Durante erba, proteine ​​Gag montare all'interno di una membrana cellulare - insieme con ALIX nelle ultime fasi - e formare una nuova particella HIV che spinge la sua via d'uscita dalla cella - il processo attraverso il quale l'AIDS in una persona infetta spread da cellula a cellula.

Per guardare il processo di erba, Ku, Saffarian e colleghi pongono cellule HeLa umani contenenti le particelle in una piccola quantità di terreno di coltura liquido in una capsula di Petri e messo sotto il microscopio, che è in una camera di vetro mantenuto a temperatura corporea in modo che il cellule possono rimanere in vita per più di 48 ore. Uno stato solido laser blu è rivolto a campione per rendere le proteine ​​Gag verde marcato ALIX e rosso con etichetta bagliore o reagiscono in modo che possano essere visti come si assemblano in una particella virale.

Con proteine ​​Gag rosso marcato e proteine ​​ALIX-etichettati verde, "abbiamo potuto vedere ALIX arriva alla fine del montaggio della particella virale", con circa 100 proteine ​​ALIX convergenti con i circa 4.000 molecole Gag e assemblaggio in una nuova particella HIV . ALIX poi porta in altre due proteine, che tagliano la particella del virus in erba fuori dalla cella quando emerge. Posizione ALIX 'durante la pizzicare fuori di nuove particelle non era stata riconosciuta prima, Saffarian dice

I ricercatori hanno guardato le particelle del virus gemma da una cella alla volta: di solito circa 100 di loro sono emersi nel corso di un periodo di due ore. Saffarian dice maggior parte delle proteine ​​ALIX sinistra quando assemblaggio HIV era completa e restituito al liquido all'interno di una cella.

Dice la scoperta che ALIX non farsi coinvolgere fino a quando le ultime fasi della gemmazione dell'HIV suggerisce l'esistenza di un meccanismo precedentemente non il virus che regola i tempi di ALIX e altre proteine ​​nel montaggio di nuove particelle di HIV.

"Abbiamo scoperto che i componenti cellulari che aiutano con il rilascio del virus in realtà arrivano in uno schema molto più complessa del previsto i tempi in base ai dati biochimici," afferma Saffarian. "Il risultato di questo studio è promettente perché scopre un nuovo meccanismo di regolazione per l'assunzione di componenti cellulari ai siti HIV in erba e apre le porte a eccitanti futuri studi sul meccanismo di gemmazione dell'HIV."

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