La tecnologia di imaging potrebbe sbloccare misteri della malattia infantile

Aprile 19, 2016 Admin Salute 0 1
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Una nuova tecnica per lo studio della struttura del virione RSV e l'attività di RSV in cellule viventi potrebbe aiutare i ricercatori a svelare i segreti del virus, tra cui come si entra nelle cellule, come replica, il numero di genomi inserisce nei suoi ospiti - e forse perché alcune cellule polmonari sfuggire l'infezione relativamente indenne. Questo potrebbe fornire agli scienziati informazioni di cui hanno bisogno per sviluppare nuovi farmaci antivirali e forse anche un vaccino per prevenire le infezioni da RSV gravi.

"Vogliamo sviluppare strumenti che ci permettono di ottenere a come funziona realmente il virus", ha detto Philip Santangelo, professore associato presso la Wallace H. Coulter Dipartimento di Ingegneria Biomedica presso la Georgia Tech e Emory University. "Abbiamo davvero bisogno di essere in grado di seguire l'infezione in una singola cellula vivente senza incidere come il virus infetta i suoi ospiti, e questa tecnologia dovrebbe permetterci di farlo."




La ricerca è stata sostenuta dal National Institutes di Istituto Nazionale di scienze mediche generali della Salute e pubblicato online prima della stampa nella rivista ACS Nano il 30 dicembre 2013. Mentre RSV sarà il primo obiettivo per il lavoro, i ricercatori ritengono che la tecnica di imaging hanno sviluppato potrebbe essere utilizzato per studiare altri virus a RNA, tra cui l'influenza e Ebola.

"Abbiamo dimostrato che siamo in grado di etichettare il genoma utilizzando i nostri sonde", ha spiegato Santangelo. "Quello che abbiamo imparato da questo è che il genoma venga incorporato nel virione, e che le particelle del virus creati sono infettive. Siamo stati in grado di caratterizzare alcuni aspetti della particella virus stesso a super-risoluzione, fino a 20 nanometri, utilizzando stocastico microscopico diretto ricostruzione ottica (dSTORM) imaging. "

RSV può essere difficile da studiare. Per prima cosa, la particella infettiva può assumere forme diverse, che vanno da filamenti di 10 micron a sfere ordinarie. Il virus può inserire più di un genoma nelle cellule ospiti e l'orientamento e la struttura RNA sono disordinata, che rende difficile caratterizzare.

Il team di ricerca, che comprendeva scienziati Vanderbilt University e Emory University, ha utilizzato una tecnologia sonda che si attacca rapidamente RNA nelle cellule. La sonda utilizza più fluorofori per indicare la presenza di RNA virale, permettendo ai ricercatori di vedere dove va in cellule ospiti - e guardare particelle infettive lasciano le cellule per diffondere l'infezione.

"Essere in grado di vedere il genoma e l'RNA prole che viene dal genoma con le sonde che usiamo davvero darci molto di più comprensione del ciclo di replica", ha detto Santangelo. "Questo ci dà molte più informazioni su ciò che il virus è davvero facendo. Se possiamo visualizzare la voce, l'assemblaggio e la replicazione del virus, che ci permetterebbe di decidere cosa andare dopo per combattere il virus."

La ricerca dipendeva da un nuovo metodo per l'etichettatura dei virus a RNA con tetravalenti sonde di imaging RNA multiply-etichettati (MTRIPS). Le sonde sono costituite da una combinazione chimerico di DNA e RNA oligonucleotide marcato internamente con fluorofori tetravelently complessate a neutravidina. La combinazione chimerico è stato utilizzato per aiutare le sonde eludere le difese cellulari.

"Ci sono un sacco di sensori nella cella che cercano RNA estera e di DNA estraneo, ma alla cella, questa sonda non sembra nulla", ha spiegato Santangelo. "La cella non vede l'acido nucleico come stranieri."

Introdotto in cellule, le sonde diffondono rapidamente attraverso una cellula infetta da RSV e si legano all'RNA del virus. Anche se strettamente vincolante, la sonda non influisce sulle normali attività del virus e permette ai ricercatori di seguire l'attività per giorni, utilizzando tecniche di microscopia standard. I MTRIPS possono essere utilizzati per integrare altre tecnologie sonda, come GFP e oro nanoparticelle.

Il lavoro fatto da studente laureato Eric Alonas concentrare il virus era essenziale per il progetto, ha detto Santangelo. La concentrazione doveva essere fatto senza danneggiare l'infettività del virus, che avrebbe influenzato la sua capacità di entrare nelle cellule ospiti.

"Ci sono voluti un po 'di lavoro per ottenere le giuste tecniche di concentrarsi la RSV," ha detto. "Ora siamo in grado di fare un sacco di virus infettivo che è etichettato e può essere conservato in modo che possiamo usare quando vogliamo."

Per studiare i progressi del contagio in singole cellule, i ricercatori hanno affrontato un'altra sfida: le cellule viventi si muovono, e seguendoli complica le ricerche. Per affrontare questo movimento, il laboratorio di Thomas Barker - anche nel Dipartimento Coulter - usato micro-fantasia fibronectina su vetro per creare 50 micron "isole" che conteneva le cellule durante lo studio.

Tra i misteri che i ricercatori vorrebbero affrontare è il motivo per cui alcune cellule polmonari sono gravemente infettati - mentre altre sembrano sfuggire effetti negativi.

"Se si guarda a un campo di celle, si vede enormi differenze da cellula a cellula, e che è qualcosa che non è intesa a tutti", ha detto Santangelo. "Se siamo in grado di capire perché alcune cellule stanno esplodendo con il virus, mentre altri non lo sono, forse possiamo trovare un modo per aiutare i cattivi sembrano più quelli buoni."

Oltre a quelli già citati, il team di ricerca comprendeva James Crowe, professore di pediatria presso Vanderbilt University; Elizabeth Wright, professore assistente presso la Scuola di Medicina presso la Emory University; Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschman, Vincent Fiore, e Alison Douglas dalla Coulter Dipartimento Wallace H. di Ingegneria Biomedica presso la Georgia Tech e Emory University; Aaron Lifland e Manasa Gudheti da Vutara Inc. a Salt Lake City, e Hong Yi dalla Scuola di Medicina Emory University.

Una delle sfide di studiare RSV è mantenere la sua attività in ambiente di laboratorio - un problema i genitori di bambini piccoli non condividono.

"Quando si gestisce questo virus in laboratorio, bisogna stare sempre attenti a che perdere infettività", ha osservato Santangelo. "Ma se si prende una stanza piena di bambini che non sono stati infettati e lasciare un bambino infettato nella stanza, dopo 15 minuti tutti i bambini sarà infettato."

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