Monitoraggio focolai infettivi dai loro genomi

Aprile 13, 2016 Admin Salute 0 1
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Lo staff medico sapeva che la donna gravemente ammalata portava un batterio resistente ai farmaci, quando entrò nel National Institutes of Health Clinical Center, un ospedale di ricerca 243 posti letto.

Un ospedale di New York City l'aveva trasferito nel giugno 2011 a far parte di uno studio clinico a NIH. A 43 anni, aveva già passate tante, tra cui un trapianto di polmone per il quale il suo sistema immunitario ha dovuto essere soppresso. Probabilmente ha contratto la polmonite Klebsiella durante una degenza ospedaliera precedente; il batterio, dopo tutto, fa sì che circa il 6 per cento delle infezioni diffuse in ospedali a livello nazionale. Peggio ancora, il suo ceppo di K. polmonite effettuata geni che hanno reso impermeabile a quasi ogni antibiotico al petto della medicina.

Il Centro Clinico NIH non aveva mai sofferto di un focolaio di polmonite K. - e non voleva un ora.




Per gestire la minaccia, l'ospedale ha messa in isolamento, contatto personale limitato, ha imposto regole severe sui visitatori, e ha richiesto l'utilizzo di guanti e camici. Durante il suo soggiorno, il paziente ha trascorso due periodi di 24 ore nel reparto di terapia intensiva, ei medici trattati sua infezione con gentamicina, colistina e tigeciclina, un farmaco più vecchio e potenzialmente tossiche dal 1940 considerato un farmaco di ultima istanza. La combinazione ha funzionato, però, e si riprese, lasciando l'ospedale nel luglio 2011. Il pericolo di un focolaio, il personale NIH credeva, era passato.

Si sbagliavano.

Due mesi dopo, ai primi di agosto 2011, un uomo di 34 anni con il cancro si ammalò di una infezione K. pneumoniae. Una cultura espettorato identificato i batteri, ma non ha potuto confermare se avesse lo stesso ceppo, come il New Yorker. I due pazienti, dopo tutto, non sono mai stati nello stesso reparto, allo stesso tempo, così la sua infezione potrebbe provenire da una sorgente separata prima che arrivasse al NIH. Tuttavia, il team Centro Clinico responsabile per il controllo delle infezioni nosocomiali cominciò a indagare i due casi.

Come tutte le buone detective, la squadra prima cercato impronte digitali. "Per decenni, abbiamo utilizzato pulsato-campo elettroforesi su gel a distinguere tra i ceppi", ha detto Tara N. Palmore, MD, vice ospedale epidemiologo del Clinical Center. Questo test produce un modello di codice a barre, come da DNA batterico che indica se i ceppi sono geneticamente simili; se i test hanno mostrato gli stessi schemi della barra, quindi i due casi potrebbero avere la stessa fonte. In K. pneumoniae, tuttavia, il 70 per cento dei ceppi negli Stati Uniti appartengono a un ceppo con uno schema campo pulsato. "Questo test non è molto utile per questo organismo", ha detto.

Inoltre, anche se l'indagine è iniziata, nuovi casi cominciarono ad apparire nel Centro Clinico al ritmo allarmante di una settimana, l'invio di brividi attraverso la leadership dell'ospedale e un crescente senso di urgenza nel team infezione-controllo. Per un ospedale pieno di ammalati di pazienti malati, un focolaio di resistenza multi-farmaco K. pneumoniae potrebbe essere disastroso. Il microbo diffonde comunemente in unità di terapia intensiva o unità di terapia intensiva - in particolare in pazienti con sistema immunitario soppresso - che producono un tasso di mortalità del 40 per cento. Il team ha rapidamente applicata una serie di strumenti di epidemiologia per controllare la trasmissione, ma molte domande senza risposta rimaneva con le tecniche attuali - e l'epidemia continua a diffondersi.

Nonostante gli sforzi eroici per isolare e pazienti affetti separati, far rispettare le precauzioni di igiene delle mani e di controllo delle infezioni e disinfettare grandi sezioni del Centro Clinico - compreso l'uso di vapore di perossido di idrogeno per decontaminare le camere e strappa fuori grondaie lavello contaminati - i batteri infine colonizzate 17 pazienti nei prossimi cinque mesi. Six sarebbe ammalarsi e morire per l'infezione. Altri cinque sono morti per la loro malattia di base, mentre attivamente infettato. I restanti otto sopravvissuti perché K. pneumoniae può entrare nel corpo, colonizzare il tratto gastrointestinale, ma non causano la malattia. Pazienti colonizzati, tuttavia, possono involontariamente servire come serbatoi batteriche capaci di trasmettere infezioni ai pazienti vulnerabili, o anche infettare se stessi batterio si sposta in una parte vulnerabile del corpo.

"E 'molto difficile da contenere l'epidemia, una volta questo tipo di organismo vengono introdotti nell'ambiente ospedaliero", ha detto David Henderson, MD, vice direttore NIH Clinical Center per la cura clinica e direttore associato per la garanzia della qualità e l'epidemiologia dell'ospedale. "Diventano endemica e parte della flora ospedale."

Una prospettiva deprimente dato la virulenza di K. pneumoniae.

All'inizio del focolaio, posizione unica del Clinical Center nel campus di 400 acri del National Institutes of Health ha pagato. Dietro l'ospedale, in un edificio di ricerca di base, un team guidato da Julie Segre, Ph.D., un ricercatore senior presso Human Genome Research Institute Nazionale (NHGRI), ha offerto di aiutare. Responsabile della sezione di biologia epiteliale della Genetica e Biologia Molecolare intramurale Branch, Dr. Segre aveva lavorato con Dipartimento di Microbiologia Clinica del Centro Clinico per studiare l'evoluzione dei batteri antibiotico-resistenza quando ha sentito parlare l'epidemia.

"Stavamo già cercando di sviluppare strumenti di diagnostica molecolare clinica," ha detto il dottor Segre, "Abbiamo pensato che potevamo usare il sequenziamento del genoma di dire se il pneumoniae K. dal primo paziente è stato lo stesso ceppo di quello che ha infettato il secondo paziente. "

Il sequenziamento del genoma produce un elenco ordinato di As, Ts, Cs e Gs che rappresentano le subunità chimiche (nucleotidi) del DNA, il lungo filo che memorizza le informazioni genetiche in una cella. Il sequenziamento di genomi batterici fornisce dati molto più precisi rispetto all'approccio gel pulse-campo. Quando il più vecchio gel impulsi campo produce un codice a barre, sequenza dà l'ordine esatto di lettere genetiche, consentendo ai ricercatori di individuare e tenere traccia delle modifiche anche a singolo nucleotide.

In sostanza, il sequenziamento del genoma misura evoluzione batterica in tempo reale. I batteri si riproducono rapidamente, alcune specie prendendo solo 20 minuti per produrre una nuova generazione. Nonostante l'accuratezza della replicazione del DNA, tuttavia, ogni generazione successiva ha una piccola probabilità di portare un nuovo errore - la sostituzione di un nucleotide, dire un A sostituito da un G - tra i 6 milioni di nucleotidi che compongono il K. pneumoniae genoma. I genetisti chiamano queste variazioni cambiamenti, o, quando causano malfunzionamenti, mutazioni. Variazioni genomiche si verificano regolarmente, e le più variazioni che si accumulano, più l'attuale generazione di batteri si è evoluta dal ceppo. "Il sequenziamento del genoma può essere usato come un timestamp evolutivo per i batteri", ha detto Segre.

Sequencing, Dr. Segre ragionò, dovrebbe fornire un potente mezzo per mostrare la parentela di batteri in molti pazienti affetti. Se i pazienti trasportati K. pneumoniae con genomi sostanzialmente identiche, quindi i batteri passavano da paziente a paziente all'interno del centro clinico. Drammaticamente diversi genomi probabilmente significava i batteri provengono da una fonte indipendente.

La strategia è diventato possibile solo perché i costi di sequenziamento e tempi di turn-around sono crollati negli ultimi anni, raggiungendo un punto in cui il NIH intramurale Sequencing Center (NISC) in Rockville, Md., Gestito da NHGRI, potrebbe effettivamente permettersi di analizzare un gran numero di campioni di pazienti e campioni ambientali e fornire i risultati in tempi di risposta clinicamente rilevante.

"Questo è stato così bello", ha detto NISC direttore James Mullikin, Ph.D. Questa esperienza ha mostrato che la sequenza "può aiutare a risolvere misteri medici in ambito clinico."

Il Centro Clinico accettato subito l'offerta di NHGRI.

Nel frattempo, il senso di urgenza stava crescendo. Tutti i primi pazienti erano in terapia intensiva (ICU). A settembre, l'antibiotico-resistenti K. pneumoniae era diffuso ai pazienti in camere normali del Centro Clinico. Il team di controllo delle infezioni preoccupato era stato isolando il personale medico e attrezzature da agosto, così chi si occupa di pazienti infetti è rimasto solo con i pazienti, per prevenire ogni possibile contaminazione incrociata. Questa strategia, chiamato cohorting, è estremamente dirompente e costoso. Il team di infezione-controllo ha iniziato a raccogliere tamponi rettali da ogni paziente in ospedale per cercare segni di silenzio colonizzazione K. pneumoniae.

Il compito era enorme. Più di 1.100 pazienti passati per il Centro Clinico all'altezza del focolaio; tutti bisogno di test regolari.

Le squadre NHGRI e NISC andato di nuovo all'inizio del focolaio e sequenziato il genoma del K. pneumoniae che ha infettato il primo paziente. Le sue cartelle cliniche suggeriscono che il New Yorker era stato infettato da molti mesi. Durante il suo soggiorno di quattro settimane presso NIH, i medici avevano isolato i batteri da campioni di gola, i polmoni, inguine e urine. Il primo passo è stato quello di sequenziare il genoma dei batteri in modo che possa essere utilizzato per determinare se l'epidemia ha iniziato con lei.

Per sequenziare un genoma batterico, il microbo deve prima essere isolato da un paziente e cresciuto durante la notte in laboratorio per la produzione di cellule sufficiente. Il personale del NIH intramurale Sequencing Center poi purificato il DNA e corse attraverso un sequencer. Questo processo richiede un paio di giorni.

"Siamo in grado di fornire il tempo di sequenziamento turnaround che è necessario per risolvere i casi e salvare vite umane", ha detto Mullikin. "Si desidera ottenere le informazioni al centro clinico in modo che sappiano come fermare l'epidemia prima."

Con i dati di sequenza in un computer, Evan Snitkin, Ph.D., un borsista post-dottorato nel laboratorio NHGRI Segre, ha iniziato a guardare le differenze tra i diversi campioni batterici.

In sostanza, il dottor Snitkin confrontato campioni di genoma batterico per vedere quello che è lo stesso e ciò che è diverso. Quando una lettera DNA è cambiato in un genoma, i ricercatori chiamano questo un singolo nucleotide variante o SNP (pronunciato "snip"). SNPs si verificano per tutto il tempo durante la divisione cellulare normale. La maggior parte dei SNPs producono alcun effetto; qualche causa mutazioni dirompenti. Ogni SNP può produrre un fingerprint identificabile utile per il monitoraggio delle epidemie.

Campioni SNP da diversi siti del corpo del New Yorker ha mostrato che era stata colonizzata abbastanza a lungo per l'evoluzione dei batteri che si verifichi. Il modello di SNPs dai batteri nelle urine ha mostrato la coerenza con il genotipo ancestrale di K. pneumoniae. Ma i campioni dai suoi polmoni e inguine dove diversi: Ogni condivisi 3 SNPS rispetto alla forma ancestrale. Il campione gola ha mostrato ancora altri tre SNPS nel genoma 6 milioni di nucleotidi. Tutti questi isolati sono chiaramente derivati ​​dallo stesso ceppo originale, ma a livello di sequenza, anche questi piccoli numeri di varianti fatto urine, polmone, inguine e la gola isolati distinti l'uno dall'altro.

Queste distinzioni fornirebbero potenti indizi. Quando il metodo gel pulse-campo ha fatto tutti i campioni sembrano identici, il sequenziamento del genoma potrebbe differenziarli con precisione, fino a una singola lettera genetica. Ora la squadra NIH potrebbe monitorare come i batteri si diffondono.

Tradizionalmente, detective epidemiologici traccia l'ordine in cui i pazienti si ammalano e cercare di unire i puntini con possibile sovrapposizione in reparti specifici in giorni specifici. I medici di solito si aspettano paziente 1 per dare l'infezione di paziente 2 e paziente 2 per dare al paziente 3, e così via. Che funziona bene se i pazienti si ammalano nell'ordine in cui sono stati colonizzati.

Questa epidemia non sarebbe così semplice. The New Yorker era stato dimesso tre settimane prima della seconda paziente si ammalò. Il terzo caso non nasce per altri 10 giorni, più di un mese dopo il primo paziente ha lasciato il centro clinico. Inoltre, non vi era alcuna filo evidente per collegare questi punti. Paziente 2 mai sovrapposti con paziente 1 in ospedale.

I dati genomici inizialmente complicato ulteriormente le cose. Il genoma del paziente 2 era 2 SNPs diverso da paziente 1, suggerendo che non è venuto direttamente dal paziente 1. Poiché i dati di sequenza versato in, il quadro diventa più chiaro e il personale dell'ospedale infezione-controllo e di Drs. Palmore e la squadra di Segre hanno creato una mappa di trasmissione. I risultati sono stati sorprendenti: paziente 1 ha trasmesso i batteri ad altri pazienti in due diverse occasioni, dalle infezioni in varie parti del suo corpo, la creazione di due grandi gruppi di pazienti infetti.

La prima trasmissione è passato da 1 paziente a paziente 3, il secondo per mostra segni di malattia; Paziente 3 ha dato al paziente 2, il primo nuovo paziente ad ammalarsi. Monitoraggio epidemiologico ha dimostrato che il paziente 3 si sovrappongono con paziente 1 in terapia intensiva, dove presumibilmente si è verificato la trasmissione. Questi individui sono stati infettati con i batteri che hanno condiviso i modelli SNP con il paziente 1 di inguine e polmone campioni.

Un secondo evento, completamente separato trasmissione legata al paziente 1 di gola isolate - identificato solo con i dati genomici - al paziente 4, per i quali è stato possibile trovare alcun collegamento con paziente 1. Paziente 4 ha continuato a infettare i pazienti che hanno superato l'10 K. pneumoniae isolare al più grande gruppo di pazienti affetti in questa epidemia.

Dati genomici anche identificato una trasmissione finale Paziente 1 Paziente 8, per i quali non legame epidemiologico potrebbe essere trovato.

L'indagine intensiva ha portato a varie scoperte sorprendenti: K. pneumoniae è più resistente di quanto precedentemente indicato in ambiente ospedaliero, che può diffondere i batteri. I ceppi del focolaio sono stati trovati in sei scarichi lavandino che erano poi strappato e sostituito, e in un ventilatore che era stato accuratamente puliti dopo l'uso da parte del paziente 6. Batteri dal focolaio anche stati trovati nella stanza del paziente 8 dopo che era stato puliti.

"Loro non sapevano come venivano trasmessi i batteri", ha detto Mullikin di NISC. "Hanno assunto che era da paziente a paziente, ma stava attraversando un lavandino. Non avrebbero mai immaginato che, come possibilità, senza i dati della sequenza per dimostrarlo."

I batteri sono sopravvissuti anche le procedure di decontaminazione standard. "Se il paziente A è nella stanza d'ospedale, e pulire accuratamente la camera, e il paziente successivo si ammala con lo stesso isolato, allora sai che il tuo metodo di pulizia non è sufficiente", ha detto il dottor Segre. I risultati genomici iniziato cambiando procedure ospedaliere.

Le analisi della sequenza ha mostrato tutte le infezioni originate con paziente 1 e non da fonti diverse, una conclusione difficile da dimostrare con altre tecniche. Lo studio infezione-controllo, tuttavia, mai determinato l'esatto meccanismo mediante il quale i batteri passati da un paziente all'altro; ci possono essere stati alcuni individui o pazienti che sono stati in silenzio colonizzate e passavano i batteri ai pazienti suscettibili. Può anche essere stata approvata dal personale ospedaliero e attrezzature.

Gli interventi di controllo delle infezioni hanno avuto successo, ed entro la fine dell'anno, non nuovi casi emersi nel Centro Clinico, arginare l'epidemia.

"Questo studio mette in chiaro che il sequenziamento del genoma, in quanto diventa più conveniente e rapido, diventerà uno strumento fondamentale per l'epidemiologia sanitaria in futuro", ha detto il Clinical Center Dr. Henderson. La sua squadra sta preparando un documento che illustrerà l'uso di sequenziamento del genoma all'interno della metodologia di controllo delle infezioni per i focolai simili. "Ora che sappiamo che cosa sequenziamento del genoma può fare," ha detto, "mi aspetto questa metodologia sarà rapidamente adottato dalla comunità epidemiologia dell'ospedale."

Più di un milione di infezioni nosocomiali si verificano in tutto lo spettro della sanità ogni anno; in soli ospedali, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie stima che uno su 20 pazienti ospedalizzati ha una infezione nosocomiali. Queste infezioni possono essere in pericolo di vita e anche di aggiungere le nostre crescenti costi sanitari, che rappresentano per miliardi di dollari in spese sanitarie in eccesso ogni anno. Resistente Multi-droga K. pneumoniae è tra le infezioni più temute perché esistono pochi trattamenti efficaci e ha un tasso di mortalità del 40 per cento.

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